四价mRNA疫苗激发针对牛痘和猴痘病毒抗原的有效免疫应答
2022年人类猴痘病毒感染的quanqiu暴发引起了公众对人畜共患疾病人际传播威胁的卫生关注。
鉴于有证据表明，包括牛痘和骆驼痘在内的其他正痘病毒也报告对人类具有传染性，并且存在天花从实验室意外逃逸的风险，此迫切需要开发一种具有广泛预防正痘病毒的痘病毒疫苗，以储备以应对未来的紧急情况。
在这项研究中，我们构建了一种新的痘病毒候选疫苗mRNA-ALAB-LNP，编码牛痘病毒抗原A27、L1、A33和B5。单次免疫后，小鼠即产生强效的抗L1特异性抗体，和中等程度的抗A33-、抗A27 -和抗B5特异性抗体反应。第二次接种后，四种抗原的抗体反应均显著增强，IgG滴度均>5 logs，其中抗A33的 IgG滴度zuigao。
实验结果
设计了一个常规的mRNA序列，包含帽结构、5'UTR非翻译区、CDS翻译区、3'UTR非翻译区和PolyA 结构。CDS翻译区表达4个串联的VACV抗原分子(A27, L1, A33, B5)被连接体分离，mRNA分子命名为mRNA- ALAB。在完整的mRNA序列的5'端添加一个T7启动子和在3'端添加一个BspQI限制性内切酶切割位点（图1A）。用BspQI酶切质粒可以有效地线性化质粒模板(图1B)。以线性化质粒为模板，通过体外转录反应合成了mRNA-ALAB分子。琼脂糖凝胶电泳和HPLC-SEC分析表明，合成mRNA具有良好的完整性(图1C)和纯度(图1D)。
图1: mRNA-ALAB的结构设计和制备
本研究中，使用迈安纳微流控设备INano L进行脂质和RNA的充分混合，空载LNP和包载了RNA的LNP的粒径分别为75nm和84nm（图2B），PDI<0.1显示了良好的均一性，包封率约为98%。转染293T细胞，抗A27, L1, A33, B5的阳性率分别为20%, 85%, 6% 和75%（图3）。
图2: mRNA-ALAB-LNP的准备和表征
图3: 转染mRNA-ALAB-LNP后四种靶蛋白的表达
mRNA-ALAB-LNP疫苗在小鼠中诱导了强效的抗原特异性结合抗体反应
为了研究mRNA疫苗的免疫原性，6-8周龄BALB/c小鼠以2周间隔肌肉注射2次疫苗(图4A) ，每次注射剂量为20ug。于shouci注射前3天、第14天(shouci注射后2周)、第28天(shouci注射后4周)和第42天(增强注射后2周)，采血取样，检测抗原特异性结合抗体(图4B-4E)。第二次免疫后45 d取脾进行细胞免疫评价。在diyi次免疫后，诱导了强效的抗L1特异性和中等的抗A33 -、抗A27 -和抗B5特异性抗体反应，并且针对所有四种抗原的抗体反应随着时间的推移而增加。同时，加强免疫后4种抗原的抗体水平显著升高。这些结果表明，mRNA -ALAB- LNP疫苗能够诱导强效的抗原特异性结合抗体反应。
图4：mRNA-ALAB-LNP在小鼠体内引起强效抗体反应
mRNA-ALAB-LNP疫苗免疫血清展现了强效的痘病毒中和活性
为了确定mRNA -ALAB- LNP疫苗产生的抗体是否具youbing毒中和活性，我们用100 CCID50 VACV病毒和增强疫苗注射后2周的灭活血清孵育，以检测中和活性。通过观察和分级细胞病变效应(CPE)来计算血清中和活性。病毒对照(VC)和空载LNP免疫血清，在1:80的稀释下，未表现出中和活性，感染的BSC-1细胞显示出明显的CPE(图5A)。相反，mRNA -ALAB- LNP接种小鼠的免疫血清，在1：80和1：640和1：1280的稀释下，在感染的BSC-1细胞中未见CPE，显示出细胞免受病毒感染的保护(图5A)。在本实验中，mRNA -ALAB- LNP的平均中和抗体滴度可达1431 (图5B)。
图5：mRNA-ALAB-LNP诱导出抗牛痘病毒的强效中和抗体
mRNA-ALAB-LNP疫苗在小鼠体内诱导抗原特异性细胞免疫反应
为了探讨mRNA疫苗是否能诱导小鼠特异性细胞免疫应答，在增强针注射45 d后收集小鼠脾细胞，分别用ELISPOT法检测针对6种抗原肽文库A27、L1-1、L1-2、A33、B5-1、B5-2的特异性IFN-γ阳性T细胞。对所有四种抗原均检测到特异性IFN-γ应答，且应答显著高于空白LNP免疫对照组(图6A)。A27肽库和A33肽库对IFN-γ的刺激水平较高，分别为904个点/百万细胞和27747个点/百万细胞。与抗A33的总特异性IgG应答zuigao一致(图3D)，对A33肽库的应答中IFN-γ应答也zuigao(图6B)。
图6：mRNA-ALAB-LNP诱导小鼠细胞免疫应答(n=4)
mRNA-ALAB-LNP接种小鼠血清显示针对猴痘病毒同源抗原的高水平交叉结合效应
将mRNA-ALAB-LNP免疫小鼠的免疫血清依次稀释，与4种蛋白A29、M1、220 A35和B6孵育，检测交叉结合抗体滴度。ELISA结果显示，shouci免疫后对猴痘抗原A35、M1、222、A29和B6均有较强的血清IgG应答，且随着免疫时间的延长，抗体滴度逐渐升高。(图7A- 223 7D)。抗A29抗体平均滴度从2040 (初次免疫后2周)增加到4440 (初次免疫后4周)，抗M1抗体从74520 (初次免疫后2周)增加到184680 (初次免疫后4周)，抗A35抗体从2520 (初次免疫后2周)增加到9000 (初次免疫后4周)，抗B6特异性抗体从5880 (初次免疫后2周)增加到10920 (初次免疫后4周)。此外，增强免疫2周后，4种抗体水平均显著升高，其中抗A29、抗M1、抗A35和抗B6抗体滴度分别达到110000、2430000、558000和1782000。总之，这些结果表明，编码牛痘抗原(A27、L1、232、A33和B5)的mRNA-ALAB-LNP疫苗在小鼠体内诱导了针对各自猴痘抗原(A29、M1、A35和B6)的等效或更好的交叉反应抗体。(图7 A-7D)。
图7：mRNA-ALAB-LNP可诱导针对MPXV抗原的强效交叉反应抗体。
综上所述，本研究基于牛痘病毒抗原A27, L1, A33、B5，开发了一种新的四价mRNA-ALAB-LNP疫苗，具有潜在的抗正痘病毒的潜力。该候选疫苗对牛痘病毒和猴痘产生了显著的抗体应答。这些数据证明了mRNA-ALAB- 282 LNP疫苗设计的可行性，并提供了其作为广泛的正痘病毒候选疫苗的潜力的初步证据。
文献来源：
Su et al., A Quadrivalent mRNA immunization elicits potent immune responses against vaccinia and monkeypox viral antigens – a step closer to a broad orthopoxvirus vaccine. bioRxiv. Doi: 10.1101/2023.04.23.537951.
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