深度解析LNP和mRNA对mRNA疫苗注射部位早期先天性免疫反应的影响

材料与方法

实验设计：本研究使用雌性BALB/c小鼠作为实验模型，通过肌肉注射给予LNP、LNP-mRNA或生理盐水作为对照。在注射后不同时间点（2小时、16小时和40小时）收集注射部位肌肉组织，进行单细胞RNA测序分析。

单细胞RNA测序：使用10x Genomics平台进行单细胞RNA测序，构建注射部位肌肉组织的单细胞转录组图谱。通过差异基因表达分析、主成分分析（PCA）和细胞间相互作用网络分析等方法，系统解析mRNA疫苗在注射部位诱导的免疫反应。

功能验证：通过ELISA、IFN-γ ELISpot和流式细胞术等方法，验证IFN-β在mRNA疫苗诱导的细胞免疫应答中的作用。

实验结果

2.1 注射部位免疫反应的主要轴：

通过主成分分析（PCA），我们对mRNA疫苗在注射部位诱导的免疫反应进行了系统性解析。结果显示，这些免疫反应主要分为两个轴：

• PC1轴：代表由脂质纳米颗粒（LNP）成分驱动的基质细胞炎症反应。这一轴的反应在空LNP（不含mRNA成分的LNP）和LNP-mRNA注射后均显著增强，表明LNP本身具有强大的佐剂效应，能够诱导基质细胞（如成纤维细胞、内皮细胞和壁细胞）产生炎症反应。

• PC2轴：代表由mRNA成分驱动的树突状细胞（DCs）I型干扰素（IFN）反应。这一轴的反应特异性地出现在LNP-mRNA注射后，而在空LNP注射后未观察到显著变化。这表明mRNA成分在注射部位能够特异性地诱导DCs产生I型IFN反应。

2.2 mRNA在注射部位成纤维细胞中的富集：

通过单细胞RNA测序分析，我们详细剖析了mRNA疫苗在注射部位各细胞类型中的分布情况。结果显示，mRNA疫苗中的mRNA在注射部位成纤维细胞中高度富集。特别是在注射后16小时，成纤维细胞中的mRNA含量显著高于其他细胞类型。

进一步的分析还表明，成纤维细胞在注射mRNA疫苗后表达IFN-β基因（Ifnb1），且这种表达特异性地由mRNA成分诱导。空LNP注射后的成纤维细胞中未检测到Ifnb1的表达，进一步证实了mRNA成分在诱导IFN-β表达中的特异性作用。

2.3 IFN-β在细胞免疫应答中的作用：

为了验证IFN-β在mRNA疫苗诱导的细胞免疫应答中的作用，我们进行了一系列功能验证实验。首先，我们通过ELISA检测了注射部位肌肉组织和血清中的IFN-β水平，发现LNP-mRNA注射后IFN-β水平显著升高，而空LNP注射后则未观察到显著变化。

接下来，我们通过IFN-γ ELISpot实验评估了不同免疫策略下小鼠的抗原特异性细胞免疫应答。结果显示，在LNP+亚单位疫苗免疫策略中，共注射IFN-β显著增强了抗原特异性细胞免疫应答。相反，在LNP+mRNA疫苗免疫策略中，由于内源性IFN-β的产生已经达到饱和水平，共注射IFN-β并未进一步增强细胞免疫应答。

为了进一步验证IFN-β在细胞免疫应答中的作用，我们还使用了IFN-β中和抗体进行阻断实验。结果显示，在LNP+mRNA疫苗免疫策略中，注射部位IFN-β信号的阻断显著降低了抗原特异性CD8+ T细胞应答。这些结果共同表明，注射部位的IFN-β在mRNA疫苗诱导的细胞免疫应答中发挥了关键作用。

除了上述发现外，我们还对注射部位成纤维细胞的动态变化进行了深入分析。通过轨迹分析，我们发现空LNP注射后，成纤维细胞群体发生了显著变化，出现了Fib_Cxcl5和Fib_Ccl19两种炎症性成纤维细胞亚群。这些亚群高表达多种趋化因子基因，能够招募免疫细胞到注射部位。

进一步的分析还表明，Fib_Cxcl5和Fib_Ccl19亚群的出现依赖于LNP成分，而mRNA成分则主要诱导成纤维细胞表达IFN-β基因。这些发现进一步强调了LNP和mRNA作为mRNA疫苗两大组分在诱导注射部位免疫反应中的不同作用。

2.5.1 DC的IFN-β响应：

为了追踪mDC_ISGs的命运，我们还对dLNs进行了单细胞RNA测序分析。结果显示，mDC_ISGs细胞群也存在于dLNs中，并且同样高表达IFN响应特征。这表明mDC_ISGs细胞不仅在注射部位产生，还能够迁移到dLNs，可能在适应性细胞免疫应答的起源中发挥作用。

2.5.3 IFN-β对DCs功能的影响：

讨论

本研究创新性的系统解析了mRNA疫苗在注射部位诱导的免疫反应，并揭示了IFN-β在促进细胞免疫应答中的关键作用。我们发现，mRNA疫苗中的mRNA成分特异性地在注射部位成纤维细胞中诱导IFN-β表达，进而激活DCs的I型IFN反应，最终促进抗原特异性细胞免疫应答。

此外，本研究还强调了LNP和mRNA作为mRNA疫苗两大组分的不同免疫佐剂效应。LNP成分主要通过诱导基质细胞炎症反应发挥佐剂作用，而mRNA成分则通过诱导IFN-β表达促进细胞免疫应答。这一发现为优化mRNA疫苗设计提供了新的思路。

本研究通过单细胞转录组学分析，深入探讨了mRNA疫苗在注射部位的早期免疫反应，特别是IFN-β在促进细胞免疫应答中的作用。我们的研究不仅增进了对mRNA疫苗免疫机制的理解，还为开发更高效、更安全的mRNA疫苗提供了科学依据。

参考文献：Kim, Seongryong, et al. "Innate immune responses against mRNA vaccine promote cellular immunity through IFN-β at the injection site." Nature Communications 15.1 (2024): 7226.