AGT mRNA替代疗法治疗原发性高草酸尿症I型的临床前研究

研究设计

使用算法和体内选择来优化AGT CDS和UTR序列。

通过检测HEK293T细胞裂解液中丙酮酸的含量，确认转染后蛋白是否具有功能，并通过免疫荧光确认AGT蛋白的细胞器定位。

在人类3D肝模型和AGT缺陷动物中分别评估hAGT mRNA的疗效。包括在Agxt-/-小鼠和大鼠中的单次给药、单次给药联合口服维生素B6、乙二醇诱导后的单次给药以及在Agxt-/-大鼠中的多次给药（每周一次，共3周）。

研究者在野生型小鼠、大鼠和食蟹猴中设计了多剂量给药的毒理学研究，检测了动物的摄食量、体重、体温、心电图和血压、血浆生化、血液学检查、血液凝固和免疫学指标。

研究结果

研究者对人类AGT蛋白在不同物种中的同源性进行了全面分析，发现其在人类、小鼠、大鼠和食蟹猴中具有高度同源性，这为后续的实验研究提供了优化基础。为了优化hAGT mRNA的稳定性和密码子使用，研究者应用了“LinearDesign”程序，通过计算机模拟和算法优化，对mRNA序列进行了精心设计，确保其在体内的稳定性和高效表达。随后，研究者将优化后的mRNA序列包装在LPP中，以实现高效的体内递送。在众多优化的mRNA序列中，2770 hAGT mRNA脱颖而出，它不仅表现出最高的密码子适应指数（CAI）值，还具有适中的最小自由能（MFE）值，这使得它在后续的实验中成为研究者的主要候选序列。

在体外转染实验中，2770 hAGT mRNA在HEK293T细胞中展现出高效的蛋白表达能力，且显著高于其他候选序列。进一步地，研究者筛选了非翻译区（UTR）组合，以增强mRNA在肝脏中的翻译效率。经过一系列实验验证，研究者发现UTR1组合的hAGT mRNA在大鼠肝脏中能够产生最高的蛋白表达水平。此外，研究者对LPP递送系统进行了表征，结果显示其粒径均匀，约为87.2 nm， PDI为0.04，包封率超过90%，平均zeta电位为-10.36 mV，这些物理特性确保了LPP能够在体内稳定地携带并递送mRNA。在稳定性研究中，研究者发现hAGT mRNA/LPP在4℃和-20℃下储存4周后，其PDI和粒径仍能保持相对稳定，但在25℃下则会出现显著增加，这提示研究者在实际应用中需要严格控制储存温度。多次冻融循环后，粒径、包封率和纯度均无显著变化，这表明研究者的制剂具有良好的冻融稳定性，能够满足实际应用中的多次冻融需求。

通过免疫荧光染色技术，研究者观察到转染hAGT mRNA/LPP的HEK293T细胞中，AGT蛋白主要分布在过氧化物酶体中，与其正常的生理功能相符合。酶活性测定实验进一步证实了这一观察结果，随着mRNA转染含量的增加，细胞内丙酮酸浓度逐渐上升。这表明AGT蛋白在转染后能够正常发挥其酶活性，催化相应的生化反应，为后续的体内实验提供了细胞水平的验证。

研究者成功构建了人类PH1肝脏3D模型，这一模型能够模拟体内肝脏的组织结构和功能，为研究PH1的病理机制和治疗方法提供了理想的平台。将构建好的3D模型转染hAGT mRNA/LPP后，研究者发现hAGT mRNA在模型中具有较高的表达水平，这表明研究者的转染方法在3D模型中同样有效。更重要的是，草酸积累量在转染后显著减少，与正常肝脏3D模型的草酸含量接近，这一结果直接证明了hAGT mRNA/LPP在恢复肝脏正常代谢功能方面的潜在疗效。通过免疫荧光染色，研究者还观察到AGT蛋白在3D模型中的表达可持续5天，且细胞未出现明显损伤，这为后续的长期治疗研究提供了希望。

在野生型Balb/c小鼠中，研究者详细研究了hAGT mRNA/LPP的药代动力学特性。结果显示，在小鼠肝脏和血液中，hAGT mRNA的表达在注射后6小时达到峰值，随后逐渐下降，48小时后趋于低水平，这表明mRNA在体内的表达具有一定的时效性。在AgxtQ84-/-大鼠中，hAGT mRNA的表达趋势与小鼠相似，且在1 mg/kg和2 mg/kg剂量下，6小时后的表达量分别为野生型大鼠的8倍和70倍，这一结果不仅验证了研究者的递送系统在不同物种中的有效性，还为后续的药效学研究提供了合适的剂量范围。Western blot和免疫组化结果进一步显示，在大鼠肝脏中，hAGT蛋白在48小时内高表达，96小时后仍可检测到，这表明研究者的mRNA替代疗法能够在体内持续产生具有功能的AGT蛋白。在食蟹猴中，hAGT mRNA在肝脏中的表达在第一次和第三次注射后的48小时达到高峰，144小时后仍可检测到，这一结果提示研究者的疗法在非人灵长类动物中也具有良好的表达效果，为未来的临床试验提供了重要的参考数据。

讨论

本研究系统地评估了mRNA蛋白替代疗法在两种不同的PH1模型中的安全性和有效性。通过CDS和UTR序列优化，研究者筛选出高表达的hAGT mRNA模板，并选择LPP递送系统以实现mRNA在肝脏中的持续表达。药代动力学研究表明，AGT蛋白在144小时内持续表达，Agxt-/-小鼠、Agxt-/-大鼠以及PH1患者来源的类器官均证实了hAGT mRNA/LPP的治疗效果。此外，研究者还发现hAGT mRNA/LPP在2 mg/kg剂量下仅产生适度的不良反应。

研究者观察到未来临床试验应用的局限性。尽管研究者延长了AGT蛋白活性的持续时间，频繁注射限制了其潜在应用。此外，PEG抗体的存在可能进一步阻碍更高剂量mRNA蛋白替代疗法的改进。

结论

通过结合mRNA设计与LPP递送系统，研究者成功延长了蛋白表达的持续时间，并在多种PH1疾病动物模型中降低了尿草酸水平。mRNA/LPP系统在啮齿动物和灵长类动物中均表现出安全性和耐受性。研究者的临床前实验为mRNA蛋白替代疗法在PH1患者中的治疗潜力提供了有希望的证据。