CRISPR-Cas9系统自发现以来，已迅速成为基因编辑领域的核心工具，广泛应用于疾病模型构建、生物通路解析及遗传疾病治疗。然而，CRISPR-Cas9在体内的有效递送仍是其临床应用的主要障碍。病毒载体因其高效性和组织特异性被广泛使用，但其免疫原性和基因组整合风险限制了其临床应用。非病毒载体如脂质纳米颗粒（LNP）因低毒性和可控的递送效率而备受关注，但传统LNP主要分布于肝脏，对肺等非肝脏组织的递送效率较低。本研究旨在开发一种能够高效递送CRISPR-Cas9 RNP至肺部的LNP制剂。
材料与方法
采用微流体混合技术，将可电离脂质、DOTAP、中性辅助脂质DOPE、胆固醇及PEG化脂质按特定比例混合于乙醇相，同时将Cas9蛋白与sgRNA按1:1摩尔比混合于PBS缓冲液中形成RNP复合物，两相混合后形成LNP。通过动态光散射（DLS）和ζ电位分析表征LNP的粒径、多分散性指数（PDI）及表面电荷。合成一系列可电离脂质库，通过微流体混合技术形成LNP库，并封装针对EGFP的RNP。利用流式细胞术评估各LNP在H1299细胞中的基因敲除效率，筛选出高效LNP。进一步采用设计实验（DOE）方法，优化LNP的脂质组成，评估其对RNP及单链DNA（ssDNA）的封装和递送效率。采用高通量DNA条形码技术，将特异性DNA条形码引入各LNP制剂中，混合后静脉注射至小鼠体内。6小时后收集心、肺、脾、肾、肝及淋巴结等器官，通过下一代测序（NGS）分析各器官中DNA条形码的分布，评估LNP的体内生物分布特性。
选择高效且具有肺部趋向性的LNP制剂（A14），封装针对loxP位点的双sgRNA，静脉注射至Ai14/Ai6交叉小鼠体内。通过流式细胞术和免疫组化分析肺内皮细胞、上皮细胞及免疫细胞的基因编辑效率。同时，评估该LNP制剂在编辑临床相关基因靶点（如TTR）中的效果。
实验结果
2.1 LNP制剂的筛选与优化结果：
初始离子化脂质筛选：通过高通量筛选技术，我们对24种不同的离子化脂质进行了评估，这些脂质被用于构建封装CRISPR-Cas9核糖核蛋白（RNP）的脂质纳米颗粒（LNP）。筛选过程中，我们利用流式细胞术测量了H1299细胞中增强型绿色荧光蛋白（EGFP）的敲除效率，作为评估LNP基因编辑效能的指标。结果显示，四种离子化脂质（C12-5、C14-2、C14-5、C14-7）表现出高效的基因敲除能力，其效果与商业化的CRISPRmax对照相当，甚至在某些剂量下表现更优（图1C, D）。
Figure 1. Identification of top ionizable lipids for in vitro gene knockout.
设计实验（DOE）优化LNP脂质组成：为了进一步优化LNP的脂质组成，我们采用了设计实验（DOE）方法，构建了一个包含7776种可能LNP配方的设计空间，但仅通过测试25种代表性LNP来评估。这25种LNP封装了针对EGFP的RNP和单链DNA（ssDNA），用于评估基因敲除（通过非同源末端连接，NHEJ）和敲入（通过同源定向修复，HDR）效率。结果显示，六种LNP配方（A3, A4, A5, A14, A21, A22）在H1299细胞中表现出高效的基因编辑能力，与基础配方相当。进一步的多重线性回归分析表明，离子化脂质类型对基因编辑效率的影响最为显著，其次是蛋白-脂质重量比和DOPE含量（图3）。
Figure 2. Optimizing LNP excipient components for RNP and ssDNA delivery and resulting knock-in editing using a design of experiment (DOE) approach. (A) DOE allows for a design space of 7776 LNPs to be analyzed by testing only 25 LNPs.
Figure 3. Identifying LNP components that significantly influence knockout and knock-in efficiencies.2.2 体内生物分布评估结果：
高通量DNA条形码技术：为了评估LNP在体内的生物分布特性，我们采用了一种高通量DNA条形码技术。每种LNP制剂中引入了特异性DNA条形码，混合后静脉注射至小鼠体内。6小时后，收集心、肺、脾、肾、肝及淋巴结等器官，通过下一代测序（NGS）分析各器官中DNA条形码的分布。结果显示，不同LNP制剂在体内的生物分布存在显著差异，但基于DOTAP的肺部趋向性机制在高通量筛选中未得到准确反映（图4）。Figure 4. High-throughput evaluation of in vivo organ accumulation using DNA barcoding.对照筛选：为了验证高通量筛选的结果，我们选择了四种LNP制剂（基础LNP、A9、A14、A24）进行个体对照筛选。这些LNP被标记上DiR荧光染料，并单独静脉注射至小鼠体内。通过体内成像系统（IVIS）观察LNP在肺部的积累情况。结果显示，A9、A14和A24在肺部的积累量显著高于基础LNP，尤其是A9表现出最高的肺部积累（图4F）。然而，高通量筛选中未准确预测到A9的高肺部趋向性，这可能与凝血机制及LNP剂量有关。Figure 5. Four LNP formulations identified the base LNP, A9, A14, and A24 show dose-responsive editing in vitro and limited toxicity only at the highest dose tested.
2.3 体内基因编辑评估结果：
Ai14/Ai6交叉小鼠模型中的基因编辑：为了评估LNP在体内的基因编辑效率，我们选择了高效且具有肺部趋向性的A14 LNP制剂，封装了针对loxP位点的双sgRNA，并静脉注射至Ai14/Ai6交叉小鼠体内。通过流式细胞术分析，我们发现A14 LNP在肺内皮细胞、上皮细胞及免疫细胞中均实现了高效的基因编辑，编辑效率随剂量增加而提高（图6C, D）。特别是在单次注射后，A14 LNP在肺单核细胞中的编辑效率达到近8%，在内皮细胞和上皮细胞中分别达到16%和6%。TTR基因编辑模型中的特异性：为了评估A14 LNP在编辑临床相关基因靶点中的特异性，我们构建了TTR基因编辑模型。A14 LNP封装了针对TTR的sgRNA，并静脉注射至小鼠体内。结果显示，A14 LNP仅在肺部实现了高效的TTR基因编辑，未观察到肝脏脱靶效应（图6F）。相比之下，基础LNP在肺部和肝脏均实现了基因编辑，导致血清中前白蛋白水平显著降低。这一结果表明，A14 LNP制剂具有高度的特异性，能够有效避免肝脏脱靶效应。Figure 6. Base, A14, and A24 LNP formulations show variable biodistributions and gene editing in vivo. 讨论
本研究成功开发了一种具有肺部趋向性的LNP制剂（A14），该制剂能够高效递送CRISPR-Cas9 RNP至肺内皮和上皮细胞，实现针对模型报告基因及临床相关基因靶点的基因编辑，且在肝脏中未观察到脱靶效应。这一发现为CRISPR-Cas9技术在肺部疾病治疗中的应用提供了新的递送策略，具有广阔的临床应用前景。
参考文献：Haley, Rebecca M., et al. "Lipid Nanoparticles for In Vivo Lung Delivery of CRISPR-Cas9 Ribonucleoproteins Allow Gene Editing of Clinical Targets." ACS nano (2025).
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