LNPs作为一种有前景的核酸药物和疫苗递送系统，已广泛应用于包括癌症在内的多种疾病的治疗中。mRNA疫苗能够通过LNPs将编码特定抗原的mRNA递送至抗原呈递细胞（APCs），如DCs，进而诱导强烈的抗癌免疫反应。然而，尽管LNPs在mRNA疫苗递送中表现出色，但其在circRNA疫苗递送中的应用仍需进一步探索。LNP的组成，包括可电离脂质、辅助脂质、胆固醇及其他成分，对疫苗的递送效率和免疫效果具有重要影响。因此，本研究旨在系统评估不同LNP组成对circRNA疫苗递送及T细胞应答的影响。
材料与方法
本研究使用了六种可电离脂质（SM-102、MC3、ALC-0315、CL1、cKK-E12、OF-C4-Deg-Lin）、三种辅助脂质（DSPC、DOPE、9A1P9）以及不同摩尔比的胆固醇和β-谷甾醇。此外，还使用了编码萤火虫荧光素酶的mRNA（mRNA-fLuc）作为蛋白质表达研究的模型，以及两种已验证治疗潜力的小circRNA疫苗（circRNA-SIINFEKL和circRNA-E7）用于T细胞应答研究。
结果与讨论
2.1 LNP组成对体外转染及蛋白质表达的影响：
在体外实验中，我们系统地评估了不同LNP组成对DC2.4细胞的转染效率和蛋白质表达的影响。首先，使用编码萤火虫荧光素酶（fLuc）的mRNA（mRNA-fLuc）作为模型，制备了包含六种不同可电离脂质（SM-102、MC3、ALC-0315、CL1、cKK-E12、OF-C4-Deg-Lin）的LNPs。结果表明，SM-102 LNP在DC2.4细胞中的转染效果较好，显著高于其他可电离脂质。在蛋白质表达方面，SM-102 LNP同样表现出最佳性能，在所有测试浓度下（0.5、1、2 μg/mL mRNA）均诱导出较高的荧光素酶表达。进一步地，我们评估了三种辅助脂质（DSPC、DOPE、9A1P9）对转染效率的影响。结果显示，基于SM-102的可电离脂质，DOPE LNP在DC2.4细胞中的转染效果较优，尽管DSPC和9A1P9 LNP之间的转染效率差异不显著。最后，我们研究了不同胆固醇和β-谷甾醇摩尔比对LNP转染效率和蛋白质表达的影响。实验发现，含有19%胆固醇和19.5% β-谷甾醇摩尔比的LNP（F3）在体外实验中表现出最高的mRNA和circRNA转染效率。然而，在蛋白质表达方面，虽然F3 LNP表现出较高的水平，但与其他配方相比差异并不显著。Fig. 1. Physicochemical properties and the in vitro characterization of the six mRNA-fLuc-LNPs. Fig. 2. In vivo LN delivery of mRNA-fLuc by six different ionizable LNPs.2.2 LNP组成对体内递送及T细胞应答的影响：
在体内实验中，我们通过皮下注射的方式将mRNA-fLuc LNPs注入BALB/c小鼠的足垫，并评估其在引流淋巴结（PO LNs）中的递送效率和蛋白质表达。IVIS生物发光成像结果显示，SM-102和ALC-0315 LNP在注射后6小时和24小时均表现出最高的荧光素酶表达。这表明这两种LNP配方在体内递送mRNA方面具有显著优势。为了评估circRNA疫苗的免疫原性，我们将编码SIINFEKL抗原的小circRNA（circRNA-SIINFEKL）加载到LNPs中，并皮下注射到C57BL/6小鼠体内。免疫后21天，通过流式细胞术分析外周血单核细胞（PBMCs）中的抗原特异性CD8+ T细胞比例。结果显示，SM-102和ALC-0315 LNP诱导的SIINFEKL特异性CD8+ T细胞比例显著高于其他配方。此外，我们还评估了不同胆固醇和β-谷甾醇摩尔比对circRNA疫苗诱导T细胞应答的影响。使用编码HPV-16 E7抗原的小circRNA（circRNA-E7）进行实验，结果显示，F1（100%胆固醇）LNP诱导的E7特异性CD8+ T细胞比例最高，尽管F3（19%胆固醇和19.5% β-谷甾醇）LNP在体外实验中表现出更高的转染效率和蛋白质表。Fig. 3. Mouse CD8+ T study response elicited by circRNA-SIINFEKL loaded in LNPs with different ionizable lipids, respectively. Fig. 4. In vitro and in vivo protein expression by mRNA-fLuc and in vivo T cell response by circRNA-E7 delivered by LNPs with different sterol lipid ratios.2.3 LNP组成对免疫细胞亚群的影响：
为了进一步探究不同LNP配方对免疫细胞亚群的影响，我们使用编码OVA抗原的circRNA（circRNA-OVA）进行实验，并评估了其在引流淋巴结中不同免疫细胞亚群中的转染效率和抗原表达。流式细胞术分析结果显示，F1和F3 LNP在CD45+淋巴细胞和DCs中转染效果较好，且F1 LNP能够显著上调MHC II表达，表明其增强DC成熟和抗原呈递的能力。这些发现与之前的蛋白质表达和T细胞应答结果一致，进一步证实了F1 LNP在诱导强免疫应答方面的优势。Fig. 5. Intracellular delivery and immune activation of immune cell subsets in mouse draining LNs upon s.c. injection of circRNA-OVA LNPs in mice.结论
本研究系统评估了不同LNP组成对circRNA疫苗递送及T细胞应答的影响。结果表明，SM-102是可电离脂质中的标线标线较优，而胆固醇和β-谷甾醇的摩尔比对LNP的递送效率和免疫效果具有重要影响。富含胆固醇的LNP（如F1）更适合于需要强免疫激活的应用，而掺入β-谷甾醇的LNP（如F3）则可能在减少促炎反应方面具有优势。这些发现为设计LNP作为circRNA治疗剂和疫苗的载体提供了重要思路。
未来研究方向
未来的研究应进一步探索LNP各成分之间的相互作用及其对LNP稳定性和递送效率的影响。此外，还应评估不同LNP配方在预防和治疗疾病中的实际效果，以优化circRNA疫苗的临床应用。
参考文献：Alshehry, Yasir, et al. "Investigation of the impact of lipid nanoparticle compositions on the delivery and T cell response of circRNA vaccine." Journal of Controlled Release (2025): 113617.
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