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胆固醇对LNP纳米颗粒结构和细胞转染效率的影响

2025年03月11日 14:25 来源:迈安纳(上海)仪器科技有限公司

“本文研究了溶致液晶相纳米结构和胆固醇在增强脂质纳米粒(LNPs)介导的巨噬细胞mRNA转染中的作用。通过开发包含可离子化脂质SM-102、辅助脂质单油酸甘油酯(MO)和胆固醇的LNPs,实现了对肺泡巨噬细胞系(MH-S细胞)的mRNA有效递送。研究利用同步加速器小角X射线散射(SAXS)技术观察到,在pH值从7降低到4的过程中,LNPs的内部纳米结构发生了从反胶束到六边形再到立方液晶相的有序转变。胆固醇被确定为提高巨噬细胞mRNA转染效率的关键组分,其有助于纳米结构转变和蛋白冠变化。本文的研究结果突出了脂质纳米结构自组装以及胆固醇在成功实现mRNA向肺巨噬细胞细胞内递送和转染中的关键作用,为基于细胞的肺病疗法中的RNA技术提供了进展。




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图一、结构示意图



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研究结果


1.1 LNP纳米结构的表征:


本研究通过改变胆固醇的含量,固定其余组分的方式制备LNP,并利用同步加速器小角X射线散射(SAXS)分析,精确地观察到了LNP纳米结构在不同pH条件下的转变过程。具体而言,在pH值从7降至4的过程中,LNP经历了从逆微胞相到六方相,再到立方相的转变。这种转变揭示了LNP在模拟细胞内酸性环境时的结构适应性,为理解LNP在细胞内的行为提供了关键信息。


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图二、不同胆固醇含量LNP的表征


1.2 胆固醇对LNP纳米结构转变的促进作用:


在较低pH环境下(如模拟成熟内涵体的pH4条件),不含胆固醇的LNP主要呈现二维有序的H2纳米结构相。然而,当LNP中含有胆固醇时,能够观察到更复杂的纳米结构转变。这种转变可能与胆固醇在调节LNP稳定性、促进mRNA从LNP中释放以及增强LNP与细胞膜融合能力方面的作用有关。这一发现为理解胆固醇如何影响LNP介导的mRNA递送过程提供了新的见解。同时,也强调了在设计高效LNP制剂时考虑胆固醇含量的重要性。


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图三、不同pH、不同胆固醇、不同N/P比例条件下LNP的结构变化


1.3 胆固醇对mRNA转染效率的影响:


实验结果显示,胆固醇的存在对于实现高效的mRNA递送至关重要。在LNP制剂中加入20mol%的胆固醇,可以显著提升mRNA的转染效率,提高幅度达到50%。这一发现强调了胆固醇在优化LNP性能、增强mRNA递送能力方面的重要作用。为了验证LNPs在原代巨噬细胞中的转染效率,实验采用了从小鼠肺泡灌洗液中分离得到的原代肺泡巨噬细胞以及从人外周血单核细胞分化而来的单核细胞衍生巨噬细胞(MDMs)。通过荧光素酶mRNA作为模型mRNA进行转染实验,发现含有20mol%胆固醇的LNPs在原代肺泡巨噬细胞和MDMs中均表现出较高的转染效率。这一结果进一步证实了胆固醇在增强LNPs介导的巨噬细胞mRNA转染中的关键作用。通过流式细胞术和共聚焦显微镜成像技术,观察了LNPs与MH-S细胞和原代肺泡巨噬细胞的结合与内化过程。结果发现,所有LNPs均与细胞紧密结合,并有效地被细胞内化。特别是在含有20mol%胆固醇的LNPs处理的细胞中,观察到了更多的LNPs被内化并定位于细胞内。这一结果表明,胆固醇的加入不仅提高了LNPs的转染效率,还促进了LNPs与细胞的结合与内化过程。


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图四、不同胆固醇含量、不同N/P比对LNP在巨噬细胞中的转染效率比较


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图五、不同胆固醇含量对LNP在原代巨噬细胞中的转染效率比较


1.4 胆固醇对LNP表面吸附蛋白的影响:


LNPs在注入体内后,会与生物流体中自然存在的生物分子(如蛋白质)发生强烈的相互作用,形成蛋白质冠。这种蛋白质冠可以显著改变LNPs的生物响应。胆固醇的存在影响了LNP表面蛋白质冠的组成。具体而言,含有胆固醇的LNPs(如CHL20和CHL40)与不含胆固醇的LNP(CHL0)相比,在蛋白质冠的组成上存在显著差异。含有胆固醇的LNPs选择性吸附了某些特定蛋白质,如补体因子H(CFH)和免疫球蛋白G3(IgG3)。补体因子H(CFH)在免疫调节中起着重要作用,能够抑制补体激活,从而可能减少LNP的免疫原性。免疫球蛋白G3(IgG3)则与Fc受体(FcγRs)相互作用,参与吞噬作用和细胞因子调节,这可能有助于增强LNPs被巨噬细胞的摄取和内化。这些蛋白质在CHL20和CHL40的蛋白质冠中显著富集,但在CHL0中则相对缺乏。这些差异表明,胆固醇不仅影响LNP表面吸附蛋白质的数量,还影响其种类和功能,从而可能对LNPs的体内行为和递送效率产生深远影响。


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图六、不同胆固醇含量对LNP表面蛋白组学

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结论



本研究开发了一种包含可离子化脂质SM-102、辅助脂质MO和胆固醇的LNPs,用于实现mRNA向巨噬细胞的高效递送。研究结果显示,LNPs具有pH敏感的溶致液晶相纳米结构,胆固醇在提高mRNA转染效率中起关键作用。本研究为基于细胞的肺病疗法提供了有前景的RNA技术进展,强调了脂质纳米结构自组装和胆固醇在成功实现mRNA细胞内递送和转染中的重要性。未来的研究将进一步探索LNPs在肺病治疗中的潜在应用,并优化其组分和结构以提高转染效率。



参考文献:Iscaro, Joshua, et al. "Lyotropic liquid crystalline phase nanostructure and cholesterol enhance lipid nanoparticle mediated mRNA transfection in macrophages." Advanced Functional Materials 34.46 (2024): 2405286.


关键词: 胆固醇

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