“信使核糖核酸（mRNA）疗法在治疗由遗传突变、慢性感染、药物和酒精滥用以及严重创伤等引起的肝脏疾病方面具有巨大潜力，每年全球有超过200万人死于这些肝脏疾病。肝脏遗传代谢疾病特别适合基于mRNA的蛋白质替代疗法和基因编辑。然而，广泛使用的聚乙二醇化（PEGylated）药物和脂质纳米颗粒（LNPs）会引发抗PEG（anti-PEG）抗体，从而在重复给药时阻碍治疗效果。为解决这一问题，研究人员设计、合成并优化了一系列聚合物脂质，以替代目前使用的1,2-二肉豆蔻酰基-rac-甘油-3-甲氧基聚乙二醇-2000（DMG-PEG2000），旨在减少anti-PEG antibodies (APAs)反应性，提高重复给药疗效。”
化学设计与合成
研究人员通过原子转移自由基聚合（ATRP）技术，合成了具有高密度刷状结构的聚合物脂质（brush-shaped poly(ethylene glycol) methyl ether methacrylate (PEGMA) lipids (BPLs) ）。这些聚合物脂质的参数，包括侧链长度、聚合度、锚链长度和表面结构，可以调节抗PEG抗体结合亲和力，并控制LNPs的血液药代动力学。与广泛使用的DMG-PEG2000相比，含有刷状聚合物脂质的LNPs在蛋白质替代疗法和基因组编辑模型中产生了更佳的治疗效果，为PEG脂质替代品的结构-活性关系提供了新的见解。具体来说，研究人员首先合成了具有不同侧链长度的DMG-PEGxMA物种（x=1, 2, 3, 5, 9, 19），这些物种共享相同的脂质起始剂DMG和相似的聚合度，但侧链长度不同。通过动态光散射（DLS）测量发现，随着侧链长度的增加，LNPs的尺寸逐渐减小并趋于稳定，当侧链长度达到5时，尺寸急剧减小并稳定在约120nm，这与DMG-PEG2000相似，适合用于体内研究。冷冻透射电子显微镜（cryo-TEM）图像显示，BPL LNPs与DMG-PEG2000 LNPs的结构相似，表明BPL LNPs具有良好的稳定性和mRNA封装效率（>90%），并且具有较低的细胞毒性。
结果与分析
2.1 聚合物化学结构对mRNA递送效率的影响：
为了确定是否可以使用具有替代化学结构和物理性质的合成聚合物作为DMG-PEG2000在LNPs中的替代品，研究人员设计了一系列具有不同化学结构的聚合物脂质。通过体外和体内实验发现，大多数聚合物脂质稳定化的LNPs能够递送mRNA，但效率不同。在体内递送中，只有约40%的LNPs能够实现有效的mRNA递送。进一步研究发现，侧链长度较长的BPL LNPs（如DMG-PEG19MA36）在体内mRNA递送效率方面表现最佳，这可能是因为较长的侧链提供了更好的水溶性和稳定性，有助于LNPs的形成和mRNA的封装。具体来说，DMG-PEG19MA36 BPL LNPs在小鼠肝脏中产生了最高的荧光信号和人红细胞生成素（hEPO）水平，表明其在mRNA递送方面的更高效性。
图1. 合成聚合物与脂质融合的纳米颗粒实现高效的mRNA递送。
2.2 聚合物结构与mRNA递送效率的关系：
通过精确控制聚合物的架构，研究人员考察了侧链长度、聚合度和锚链长度对mRNA递送效率的影响。结果表明，侧链长度的增加有助于LNPs的形成和稳定性，且随着侧链长度的增加，LNPs的尺寸减小并趋于稳定。聚合度的增加也会提高mRNA递送效率，但过高的聚合度可能会抑制细胞摄取和mRNA的释放。锚链长度对LNPs的稳定性和mRNA递送效率也有重要影响，中等长度的锚链（如n=10,12）能够提供适当的疏水相互作用，促进LNPs的稳定性和mRNA的高效递送。具体来说，DMG-PEG19MAy（y=5, 10, 21, 36, 60, 77）的聚合度研究发现，随着聚合度的增加，mRNA递送效能先增加后减少，峰值出现在聚合度为36时。这表明存在一个最佳的聚合度范围，既能提供足够的稳定性和递送效率，又不会过度抑制细胞摄取和mRNA释放。
图2：通过合成化学调控聚合物结构及其对mRNA传递效率的影响。
2.3 BPL LNPs减少APA结合并延长血液循环时间：
所有BPL LNPs均表现出比DMG-PEG2000 LNPs更少的蛋白吸附，这归功于其梳状结构，有助于延长血液循环时间。通过药代动力学研究发现，BPL LNPs的血液循环时间比线性DMG-PEG2000 LNPs更长，且随着侧链长度的增加，循环时间进一步延长。然而，聚合度的增加会导致循环时间减少，这可能与从蘑菇到刷子结构的转变有关。此外，锚链长度也会影响蛋白介导的清除，较长的锚链有助于延长LNPs的循环时间。具体来说，BPL LNPs的Flory半径（RF）值表明其侧链处于刷子状态，而聚合物主链的RF值则随着聚合度的增加从蘑菇状态过渡到刷子状态。这种结构转变影响了LNPs表面的蛋白质吸附和抗体结合亲和力，从而影响了其血液循环时间和免疫原性。
图 3. 聚合参数与聚合物状态对药代动力学特征及APA结合具有调控作用。
2.4 BPL LNPs在重复给药方案中的表现：
为了验证聚合物脂质架构和表面结构对重复给药疗效的影响，研究人员进行了重复给药实验。结果显示，与DMG-PEG2000 LNPs相比，BPL LNPs在重复给药后能够维持更稳定的mRNA递送效率。结构-活性关系研究表明，侧链长度、聚合度和锚链长度都会影响重复给药的疗效。具体来说，侧链长度较长的BPL LNPs在重复给药后的递送效率下降幅度较小，而聚合度较高的BPL LNPs则表现出较大的递送效率下降。锚链长度对重复给药疗效的影响较小，这可能是因为不同的锚链长度具有相似的聚合度和侧链长度。进一步的实验发现，在重复给药后，BPL LNPs组的小鼠血清中抗PEG IgG和IgM水平显著低于DMG-PEG2000 LNPs组，表明BPL LNPs能够有效减少免疫反应，从而维持其递送效率。
图4. 在重复给药方案的研究中，BPL LNPs 的表现显著优于 DMG-PEG2000 LNPs。
2.5 BPL LNPs克服APA抑制效应：
为了进一步验证BPL LNPs在存在APA的情况下是否能够维持疗效，研究人员进行了再挑战实验。首先给小鼠注射DMG-PEG2000 LNPs以产生APA，30天后再次注射BPL LNPs或DMG-PEG2000 LNPs。结果显示，BPL LNPs能够延长血液循环时间，降低APA水平，并在第二次给药后表现出更高的mRNA递送效率。特别是某些BPL LNPs（如DMG-PEG19MA36和DPG-PEG19MA36）在第二次给药后表现出优于DMG-PEG2000 LNPs的mRNA递送效率，表明其能够有效克服APA的抑制效应。具体来说，DMG-PEG19MA36和DPG-PEG19MA36 BPL LNPs在第二次给药后，肝脏中的荧光信号和hEPO水平显著高于DMG-PEG2000 LNPs组，表明其在克服APA抑制方面具有显著优势。
图5. BPL LNPs 可有效克服由 DMG-PEG2000 LNPs 引发的 APA 抑制效应。
蛋白质替代疗法与基因组编辑
3.1 BPL LNPs在蛋白质替代疗法中的应用：
研究人员使用Fah基因敲除（FAH−/−）小鼠模型，比较了BPL LNPs和DMG-PEG2000 LNPs在mRNA基础的蛋白质替代疗法中的效果。首先验证了BPL LNPs和DMG-PEG2000 LNPs在体外和体内的mRNA递送能力，结果显示两者均能有效表达FAH蛋白。为了模拟临床场景，研究人员在开始蛋白质替代疗法前30天给FAH−/−小鼠注射DMG-PEG2000 LNPs以产生APA。然后，小鼠每三天接受一次LNP治疗，持续33天。结果显示，接受DMG-PEG19MA36 BPL LNPs治疗的小鼠存活率显著提高，FAH蛋白表达水平也显著高于接受DMG-PEG2000 LNPs治疗的小鼠。此外，BPL LNPs治疗组的胆红素水平显著降低，表明其在改善肝脏功能方面具有更好的效果。具体来说，在治疗结束时，100%接受DMG-PEG19MA36 BPL LNPs治疗的小鼠存活，而只有37.5%接受DMG-PEG2000 LNPs治疗的小鼠存活。西方印迹分析显示，DMG-PEG19MA36和DPG-PEG19MA36 BPL LNPs治疗组的FAH蛋白表达水平显著高于DMG-PEG2000 LNPs治疗组，表明其在蛋白质替代疗法中的更高效性。
3.2 BPL LNPs在基因组编辑中的应用：
研究人员进一步研究了BPL LNPs在体内基因组编辑中的递送能力，以PCSK9基因为靶点，该基因与血液胆固醇水平调节有关。结果显示，DMG-PEG19MA36和DPG-PEG19MA36 BPL LNPs在肝脏中诱导了更高的插入和缺失（indels）效率，而DMG-PEG2000 LNPs的效率较低。进一步的基因组测序分析表明，BPL LNPs治疗组的indels效率是DMG-PEG2000 LNPs治疗组的三倍。此外，BPL LNPs治疗组的PCSK9蛋白水平在肝脏和血清中均显著降低，而DMG-PEG2000 LNPs治疗组的降低幅度较小。具体来说，DMG-PEG19MA36和DPG-PEG19MA36 BPL LNPs治疗组的PCSK9蛋白水平在肝脏中降低了约100%，而在血清中降低了约70%，而DMG-PEG2000 LNPs治疗组的PCSK9蛋白水平在肝脏中仅降低了约60%，在血清中降低了约40%。这些结果表明，BPL LNPs在体内基因组编辑中具有更高的效率和更好的治疗潜力。
图6. BPL LNPs 在蛋白质替代疗法和基因组编辑应用中展现了良好的治疗效果。
结论与展望
本研究表明，聚合物化学结构和架构控制着纳米-生物界面，这为开发具有抗污染能力、肝外递送能力和LNP制剂工程的新型聚合物提供了新的思路。进一步扩展具有抗污染能力的聚合物化学结构，将有助于深入理解LNP相关的免疫反应和疾病特异性细胞效应。研究人员预计，所报道的多功能聚合物脂质将支持稳健和持久的重复给药方案，并可能在多种疗法中找到有意义的应用。未来的研究将集中在进一步优化聚合物脂质的化学结构和架构，以提高其在不同疾病模型中的疗效和安全性。同时，研究人员还将探索BPL LNPs在其他疾病治疗中的应用潜力，如癌症、神经退行性疾病等，为这些疾病的治疗提供新的策略和方法。
参考文献：Xiao Y, Lian X, Sun Y, Sung YC, Vaidya A, Chen Z, Gupta A, Chatterjee S, Zheng L, Guerrero E, Wang X, Farbiak L, Yang Y, Diamond MI, Leal C, McDonald JG, Siegwart DJ. High-density brush-shaped polymer lipids reduce anti-PEG antibody binding for repeated administration of mRNA therapeutics. Nat Mater. 2025 Feb 28. doi: 10.1038/s41563-024-02116-3. Epub ahead of print. PMID: 40021827.
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