迈安纳｜【文献分享】LNP-αHTRA1 mRNA 改善胰腺癌氧化还原微环境

图1 LNP 负载 αHTRA1 mRNA 抑制 PDAC 的作用机制示意图

图2. 用于 LNP 递送的 αHTRA1 mRNA的设计与优化。

转染 αHTRA1 mRNA 后，PANC-1、SW1990 细胞 HTRA1 蛋白表达显著降低（图 3A）。CCK-8 实验显示，αHTRA1 mRNA 可显著抑制两种 PDAC 细胞增殖活性（图 3B）。Transwell 侵袭实验、细胞黏附实验、划痕实验结果证实，αHTRA1 mRNA 可显著降低 PDAC 细胞侵袭、黏附及迁移能力（图 3C、3D、4A）。

流式细胞术凋亡检测显示，αHTRA1 mRNA 处理组 Q2、Q4 象限凋亡细胞比例显著高于对照组，证实 αHTRA1 mRNA 可诱导 PDAC 细胞凋亡（图 4B）。综上，αHTRA1 mRNA 可有效抑制 PDAC 细胞增殖、侵袭、迁移，诱导细胞凋亡，发挥抗肿瘤活性。

图3. αHTRA1 mRNA对 PDAC 细胞增殖、侵袭及黏附的抑制作用。

对 αHTRA1 mRNA 处理及未处理的 PANC-1 细胞进行 RNA 测序，共筛选出 150 个差异表达基因（DEGs），其中上调 107 个、下调 43 个（图 5A）。KEGG 通路富集分析显示，HIF-1 信号通路为显著富集通路（图 5B）。PDAC 典型特征为纤维增殖反应，形成致密纤维化炎症微环境，诱导缺氧、抑制免疫细胞功能；HTRA1 可激活 HIF-1 通路，推测 αHTRA1 mRNA 通过抑制 HIF-1 通路改善肿瘤微环境、阻断 PDAC 进展。

对 HIF-1 通路 DEGs 进一步分析显示，血红素氧合酶 1（HMOX1）、己糖激酶结构域 1（HKDC1）表达下调，乳酸脱氢酶 C（LDHC）表达呈下降趋势（图 5C）。qPCR 验证结果与测序结果一致（图 5D），证实 αHTRA1 mRNA 可通过抑制 HIF-1 信号通路调控 PDAC 肿瘤微环境。

图5 RNA-Seq结果显示 αHTRA1 mRNA可抑制HIF-1通路。

提取 C57BL/6 野生型（WT）及 LSL-Kras^G12D/+;Pdx1-Cre（KC）小鼠胰腺原代腺泡细胞，成功构建三维胰腺类器官模型。培养过程中，腺泡细胞逐渐分化为导管细胞；KC 组类器官生长速率、导管结构大小、腺泡导管化生（ADM）数量及大小均显著高于 WT 组（图 6A）。

αHTRA1 mRNA 处理 WT、KC 类器官后，ELISA 检测显示抗体成功表达并分泌至上清液（图 6B），证实 mRNA 可有效递送并表达。对 0、4、7 天 WT、KC 类器官进行 RNA-Seq 分析，结果显示 KC 组类器官生长过程中 HIF-1 信号通路显著上调，证实该通路在 PDAC 发生发展中发挥关键作用（图 6C-6F）。

图6. 类PC器官的构建。

采用 HIF-1 抑制剂利非古特（YC-1）进一步验证 HIF-1 通路的关键作用。不同浓度 YC-1 处理 Panc02 细胞，CCK-8 实验确定 10 μM 为 YC-1 最佳有效浓度（图7A）。

培养初期（第 0 天）加入 YC-1，第 0、4、7 天观察显示，YC-1 处理后 WT、KC 类器官导管结构缩小，ADM 数量及大小显著减少（图 7B-7E）。阿尔辛蓝（AB）染色显示，WT 组仅观察到 ADM，KC 组因 Kras 突变出现少量胰腺上皮内瘤变（PanIN），证实 Kras 突变是驱动类器官向癌前病变转化的关键因素（图 7F、7G）。

CK19 - 淀粉酶（AMS）免疫荧光双染色显示，YC-1 处理组 AMS（腺泡标志物）表达上调、CK19（导管标志物）表达下调，HIF-1α 表达显著降低，证实抑制 HIF-1 通路可阻断胰腺类器官 ADM 进程、抑制 PDAC 发生（图 7H、7I）。

图7. YC -1抑制剂对WT和KC胰腺类器官中ADM进展的抑制作用。

KC 小鼠胰腺类器官培养初期加入 αHTRA1 mRNA，结果显示，与对照组相比，处理组类器官导管结构显著缩小、异型增生程度降低，PanIN 现象消失（图 8A、8B）。免疫荧光染色显示，处理组 AMS 表达上调、CK19 及 HIF-1α 表达显著下调（图 8C）。

缺氧条件下培养 PANC-1 细胞，αHTRA1 mRNA 处理 24 h 后，Western Blot 及 qPCR 检测显示，HIF-1α、HIF-1β 及 LDHC 的蛋白与 mRNA 表达水平均显著降低（图 8D、8E）。综上，αHTRA1 mRNA 可通过抑制 HTRA1 表达、阻断 HIF-1 信号通路，显著抑制胰腺类器官 ADM 及 PanIN 发生，阻断 PDAC 早期病变进展。

图8. αHTRA1 mRNA对小鼠胰腺类器官中ADM进展的抑制作用。